Há informações que os piratas franceses e holandeses já tinham estado no Brasil antes do descobrimento, pois a madeira que lhe deu o nome já era conhecida na Europa, o chamado Pau Brasil, ou Pau-de-Tinta. Com certeza, por volta de 1526, aqui estiveram e na foz do São Francisco, tanto que uma pequena baia, próxima à foz, recebeu o nome de Porto dos Franceses. Nas proximidades, ocorreu um fato que aprendemos na escola primária, o naufrágio de uma nau que trazia Dom Pero Fernandes Sardinha, primeiro bispo do Brasil, que, tendo escapado de morrer afogado, foi aprisionado e devorado pelos Índios Caetés que aí viviam. Esse episódio ocorreu em 1556. Viviam no São Francisco muitas tribos indígenas que os Tupis denominavam de Tapuias pois era assim que chamavam toda e qualquer tribo que não tivesse a mesma língua. Havia basicamente dois grupos distintos: os Tupis e os Gês.
Pearson relaciona de suas pesquisas a documentos históricos, os seguintes grupos vivendo na Bacia do São Francisco:
Os índios foram praticamente dizimados pelo elemento colonizador, por doenças, missigenação e pelas guerras.
Em 1590, Cristovão de Barros entrou pela região que hoje é o Estado de Sergipe, até o Baixo São Francisco, estabelecendo um caminho que serviu aos futuros colonizadores e para defesa contra os franceses na foz do São Francisco.
Duarte Coelho Pereira, que foi governador da colônia organizou uma expedição marítima que do mar entrou pela foz do São Francisco, tendo lutado contra os franceses que encontrou ali, fazendo escambo com os indígenas, e os expulsou. Nessa oportunidade, navegou algumas léguas rio acima.
Em 1560, um filho de Duarte Coelho, Duarte Coelho de Albuquerque, que foi o segundo donatário de Pernambuco, juntamente com Jorge, seu irmão, lutou cinco anos contra os caetés.
Os bandeirantes estiveram também no São Francisco, contando-se principalmente Matias Cardoso, Domingos Jorge Velho, Domingos Sertão, Fernão Dias Paes, Borba Gato e Domingos Mafrense. Este último subiu alguns afluentes, chegando às nascentes do Parnaíba. Em sua homenagem, existe a Vila Mafrense, no município de Paulistana, no Piauí.
No período da ocupação holandesa, o próprio Príncipe Maurício de Nassau esteve no São Francisco, tendo dominado a área alagoana, até Penedo, cidade que foi fundada em 1560.
No começo do século XVIII o desbravamento do São Francisco já estava completado, por homens vindos de Salvador e Recife, tendo sido instalados alguns aldeamentos, aumentando o povoamento nas margens do rio. Para essa fixação, concorreu a descoberta de ouro em Jacobina, no Médio São Francisco, próximo à cabeceira do afluente Salitre, e pelo povoamento do Piauí, Maranhão e Ceará. Desenvolveram-se as fazendas de criação de gado. Da mesma forma, o Alto São Francisco a essa altura, estava também povoado pelas constantes rotas de penetração que se dirigiam a Goiás. Nessa rota, muitos se fixaram, ou na exploração de diamantes e ouro, ou na manutenção de fazendas de pecuária.
João Leite da Silva Ortiz, auxiliar de Anhanguera, que em 1722 descobriu ouro em Goiás, terminou por parar no sítio onde hoje é a cidade de Belo Horizonte, montando uma fazenda na serra das Congonhas, sendo a sede no lugar que se chamava Cercado. Outros paulistas se fixaram no Alto São Francisco, fundando cidades que hoje trazem seus nomes.
A descoberta de ouro em Goiás, por volta de 1700, provocou o povoamento do Alto São Francisco, que estava na rota entre São Paulo e essas minas.
No Baixo São Francisco, segundo Pearson, o povoamento por parte dos portugueses foi dificultado pela formação de aldeamentos de escravos fugitivos da área de cana-de-açucar, que eram grandemente fortificados, enquanto o litoral era ocupado pelos holandeses (1630). O Quilombo dos Palmares foi o que mais resistência apresentou, por organização e liderança.
A região do Médio, incluindo-se aí o Submédio São Francisco, que se estende desde a Cachoeira de Pirapora, em Minas Gerais, até a Cachoeira de Paulo Afonso, entre a Bahia e Alagoas, representa, de um modo geral o trecho navegável do rio, sendo que a navegação é mais ou menos franca, apenas em 1.371 km, no estirão realmente do Médio São Francisco, ou seja, desde Pirapora até Sobradinho, sendo que daí a baixo, até Paulo Afonso, ou seja, o Sub-Médio São Francisco, a navegação é dificultada pelas corredeiras constantes.
A colonização dessa área foi efetuada em duas épocas distintas, tendo a primeira ocorrido quase um século antes da outra.
Os primeiros estabelecimentos nesse trecho do São Francisco, iniciaram-se no extremo a jusante. Exploradores vindos de Olinda, que foi fundada em 1534, e de Salvador, em 1549, se aventuraram pelo Vale, na época, entenda-se que as dificuldades eram imensas, dado a agressividade de uma natureza virgem e a constante presença de tribos selvagens.
Desses estabelecimentos, tem-se notícia de que um dos primeiros núcleos de colonização foi estabelecido em Bom Jesus da Lapa. Uma expedição vinda de Olinda, entre 1534 e 1550, adentrou a região, atingindo Lapa. Alguns anos depois, outra expedição, partindo de Salvador, aí esteve e, já na metade do século, um grupo de 200 homens fundou um estabelecimento e numerosas fazendas de gado.
No final do século XVII a história registra a existência de uma fazenda de gado, próxima à atual cidade da Barra, que no passado foi o principal posto de abastecimento do Médio São Francisco.